După perfuzia crioprotectoare, pacientul nu este pur şi simplu introdus în azot lichid.
Pacientul este răcit după un program termic controlat de computer, care durează mai multe zile. Senzorii amplasaţi în interiorul pacientului arată dacă diferitele regiuni anatomice se răcesc uniform sau dacă apar gradienţi termici periculoşi între ele.
Problema tehnică se schimbă pe măsură ce temperatura scade. La început, răcirea trebuie să limiteze formarea gheţii. În apropierea tranziţiei vitroase şi la temperaturi mai joase, precizia şi uniformitatea termică devin mai importante decât viteza de răcire.
De ce este necesară o răcire controlată
Agenţii crioprotectori reduc viteza de răcire necesară pentru a evita formarea gheţii. Ei permit ţesutului cu conţinut ridicat de apă să treacă într-o stare foarte vâscoasă, asemănătoare sticlei, în loc să cristalizeze pe scară largă.
Temperatura relevantă de tranziţie vitroasă, notată Tg, depinde de soluţie, de concentraţia ei şi de metoda de măsurare. Este un interval, nu un prag biologic universal.
Pentru soluţiile relevante în crioprezervarea umană, acest interval se situează de obicei între -120 °C şi -135 °C.
La temperaturi mai ridicate decât acest interval, o răcire prea lentă poate favoriza nucleaţia şi creşterea cristalelor de gheaţă. La temperaturi mai joase, materialul se comportă tot mai mult ca un solid fragil.
Dacă suprafaţa se răceşte mult mai repede decât centrul, diferitele regiuni se contractă în grade diferite. Tensiunea termomecanică rezultată poate produce fisuri.
Rezultă astfel un protocol strict: răcire suficient de rapidă înainte de vitrifiere, urmată de controlul gradienţilor termici şi al vitezei de răcire pe măsură ce ţesuturile intră în starea vitroasă.
Pentru explicaţia comportamentului de fază care stă la baza procesului, consultaţi materialul despre diferenţa dintre congelare şi vitrifiere.
Prima generaţie de incintă de răcire
Sistemul de primă generaţie al Tomorrow.bio, numit incinta de răcire V1, a stabilit arhitectura de bază pentru răcirea controlată a întregului corp.
Pacientul este plasat într-o incintă izolată, concepută special pentru acest proces. Un computer controlează mediul criogenic din interiorul incintei, în timp ce termocuplele măsoară temperatura în mai multe puncte.
Controlerul urmează o curbă programată, nu aplică o răcire maximă în mod continuu. Datele furnizate de fiecare senzor sunt înregistrate şi devin parte a istoricului termic al pacientului.
Această abordare diferă fundamental de imersia directă. Maşina poate încetini, opri temporar sau modifica condiţiile din incintă, în funcţie de ceea ce se întâmplă efectiv cu pacientul.
Sistemul de a doua generaţie, bazat pe vas Dewar
Sistemul de a doua generaţie al Tomorrow.bio integrează răcirea controlată într-un vas Dewar construit special pentru acest scop.
Pacientul rămâne în interiorul vasului Dewar, iar un capac specializat integrează echipamentul de răcire, comenzile computerizate, valvele, conexiunile senzorilor şi trecerile pentru termocuple.
Termocuplele sunt amplasate în mai multe puncte din interiorul pacientului. Senzori suplimentari monitorizează mediul termic din interiorul vasului Dewar.
Sistemul monitorizează astfel mai mult decât simpla valoare de referinţă setată. Sistemul urmăreşte şi viteza cu care răspund diferitele regiuni monitorizate ale pacientului.
Computerul ajustează gradientul de temperatură din vasul Dewar şi viteza de răcire pentru a menţine aceste valori în limitele prevăzute de protocol.
Un corp mare nu poate avea o temperatură perfect uniformă în timpul răcirii. Obiectivul practic este reducerea la minimum a dispersiei şi evitarea situaţiei în care o regiune măsurată se răceşte periculos mai rapid sau mai lent decât celelalte.
Forma vasului Dewar limitează, de asemenea, manipularea pacientului între răcirea controlată şi stocarea criogenică. Aceeaşi incintă închisă poate asigura un mediu stabil şi simetric în jurul pacientului.
Temperatura de referinţă nu este temperatura pacientului
Un controler poate răci mediul rapid. Nu poate face ca centrul unui corp uman să atingă instantaneu acea temperatură.
Căldura trebuie să circule din ţesuturile profunde spre suprafaţă. Geometria corpului, compoziţia sa, distribuţia crioprotectorului şi poziţia senzorilor influenţează întârzierea observată.
De aceea, un singur senzor în incintă nu este suficient. Un mediu nominal de -130 °C nu dovedeşte că fiecare parte măsurată a pacientului a atins -130 °C.
Sistemul de control trebuie să ia în considerare atât temperatura absolută, cât şi diferenţa dintre canale. Punctul care se răceşte cel mai lent, punctul care se răceşte cel mai repede şi variaţia generală a temperaturilor oferă informaţii diferite.
Calibrarea, poziţionarea şi continuitatea termocuplelor contează la fel de mult. Valorile neverosimile sau defecţiunile senzorilor trebuie semnalate, nu incluse automat în calculul curbei de răcire.
Programul de temperatură în trei etape al Tomorrow.bio
Protocolul actual are trei etape distincte. Valorile sunt ţinte operaţionale specifice acestui echipament şi acestei metode de crioprotecţie, nu constante universale valabile pentru orice sistem de vitrifiere.
1. Descreştere rapidă spre -130 °C
Prima etapă răceşte pacientul de la temperatura gheţii carbonice până la aproximativ -130 °C, atât de repede cât permite, în condiţii de siguranţă, variaţia măsurată a temperaturii.
Viteza este importantă aici pentru că regiunile insuficient protejate pot forma încă gheaţă înainte ca ţesutul să devină vitros.
Computerul nu urmăreşte doar durata procesului. El monitorizează termocuplele şi ajustează mediul de răcire din jurul pacientului.
2. O revenire controlată spre -120 °C
După atingerea a aproximativ -130 °C, răcirea activă este redusă, iar pacientul este lăsat să se încălzească natural spre aproximativ -120 °C.
Aceasta este o etapă de recoacere. În apropierea Tg, materialul crioprotejat păstrează suficientă mobilitate moleculară pentru ca o parte din tensiunea mecanică acumulată să se relaxeze.
Revenirea oferă, de asemenea, timp regiunilor mai calde şi mai reci să se apropie termic înainte ca materialul să fie dus mai adânc în starea sa vitroasă rigidă.
Recoacerea nu inversează leziunile biologice preexistente. Scopul ei este mai restrâns: reducerea gradienţilor termici şi a tensiunilor create de contracţia neuniformă.
3. Descreştere la -196 °C, cu aproximativ 1 °C pe oră
De la aproximativ -120 °C, ţinta de descreştere este de aproximativ 1 °C pe oră, până când pacientul atinge temperatura azotului lichid.
Această ultimă coborâre de 76 de grade durează aproximativ trei zile, fără a lua în calcul pauzele şi ajustările de control.
Menţinerea unei viteze de 1 °C pe oră într-un corp mare, eterogen din punct de vedere termic, este o problemă de control al procesului, nu o simplă programare a unui cronometru.
Controlerul trebuie să ajusteze permanent mediul din vasul Dewar, astfel încât temperaturile indicate de termocuplele interne să scadă concomitent, fără apariţia unor gradienţi excesivi.
Când o regiune se răceşte mai lent, coborârea prea rapidă a temperaturii mediului poate răci excesiv o altă regiune. Precizia presupune echilibrarea valorilor furnizate de toţi senzorii, nu urmărirea unei singure măsurători.
De ce este plauzibilă din punct de vedere ştiinţific etapa de recoacere
Cercetările privind vitrifierea la scară mare identifică două riscuri care trebuie echilibrate: răcirea insuficientă la temperaturi peste Tg şi tensiunea mecanică excesivă în apropierea şi sub Tg.
Un studiu din 2024 privind vitrifierea la nivelul unui organ uman a folosit mai multe sonde interne şi a concluzionat că recoacerea reduce gradienţii înainte ca materialul să intre în starea vitroasă.
Acelaşi studiu a constatat că răcirea lentă la temperaturi sub intervalul de recoacere ajută la prevenirea apariţiei unor noi gradienţi şi tensiuni mari.
O cercetare separată de termomecanică a constatat că recoacerea în apropierea Tg modifică substanţial tensiunea reziduală şi îi reduce dependenţa de viteza de răcire precedentă.
Aceste studii susţin strategia de control care stă la baza protocolului. Ele nu validează independent fiecare valoare exactă din protocolul de răcire a întregului corp folosit de Tomorrow.bio.
Întregul corp uman este mai mare şi mai eterogen decât soluţiile de laborator sau organele izolate. Înregistrările directe de temperatură şi imagistica de după răcire rămân necesare.
Ce înregistrează computerul
Rezultatul relevant nu este un simplu mesaj de tipul «răcire finalizată». Este seria temporală completă a datelor provenite de la fiecare canal de măsurare a temperaturii.
Înregistrarea trebuie să indice vitezele de răcire, pauzele, creşterile controlate de temperatură, gradienţii dintre senzori, acţiunile controlerului, alarmele şi orice abatere de la curba planificată.
Aceste date devin parte din evaluarea calităţii crioprezervării.
După răcire, o tomografie computerizată standardizată, efectuată la temperatura azotului lichid, poate evidenţia distribuţia crioprotectorului, gheaţa, deformările vizibile şi fisurile pe care datele de temperatură singure nu le pot dezvălui.
De ce se termină procesul la temperatura azotului lichid
La presiune atmosferică normală, azotul fierbe la aproximativ 77,34 kelvin, respectiv aproximativ -195,8 °C, conform NIST Chemistry WebBook.
Stocarea în azot lichid este pasivă. Cât timp vasul conţine suficient lichid, echilibrul de fierbere al azotului menţine un mediu criogenic stabil, fără refrigerare mecanică.
Răcirea controlată se încheie abia atunci când pacientul este adus la condiţiile termice necesare pentru această stare stabilă. Stocarea nu este folosită ca înlocuitor pentru procesul de răcire.
Principiile de proiectare şi compromisurile etapei următoare sunt prezentate în materialele despre vasele Dewar criogenice moderne şi stocarea la temperaturi intermediare.
Pe scurt: Tomorrow.bio foloseşte răcire computerizată şi senzori interni de temperatură. Procesul răceşte rapid în apropierea tranziţiei vitroase, reduce tensiunile termice, apoi continuă lent până la -196 °C.
Explorați acest instrument practic
Folosiți instrumentul interactiv pentru a explora întrebarea din acest articol.
Se încarcă instrumentul interactiv...
Lecturi suplimentare